Spettrometria di massa

1. Lo spettrometro di massa

Allo scopo di misurare la caratteristiche di diverse molecole, uno spettrometro le converte in ioni affinché esse possano essere deflesse e manipolate da campi elettrici e magnetici esterni. Le tre funzioni essenziali di uno spettrometro di massa e dei componenti ad esso associati sono:

Poiché gli ioni sono molto reattivi ed a vita breve, la loro formazione e manipolazione deve essere eseguita sotto vuoto. La pressione atmosferica è di circa 760 torr (mm di mercurio). La pressione sotto cui gli ioni possono essere trattati è approssimativamente da 10^-5 a 10^-8 torr (meno di un miliardesimo di atmosfera). Ognuna delle tre operazioni sopra elencate può essere realizzata in diversi modi. In una procedura comune, la ionizzazione viene effettuata da un fascio di elettroni ad alta energia, e si raggiunge la separazione degli ioni accelerandoli e focalizzandoli in un raggio, che viene allora curvato da un campo magnetico esterno. Gli ioni sono quindi rivelati elettronicamente e le risultanti informazioni vengono memorizzate ed analizzate da un computer. Uno spettrometro di massa operante in questo modo è delineato nel diagramma seguente. Il cuore dello spettrometro è la sorgente di ioni. Qui, le molecole del campione (punti neri) sono bombardati da elettroni (linee in blu chiaro) provenienti da un filamento riscaldato. Questa è denominata sorgente EI (electron-impact). I campioni liquidi volatili e gassosi hanno la possibilità di espandersi nella sorgente di ioni da un serbatoio (come mostrato), mentre i liquidi non volatili ed i solidi possono essere introdotti direttamente. I cationi che si formano dal bombardamento degli elettroni (punti rossi) sono spinti via da una piastra repulsiva caricata elettricamente (gli anioni vengono attratti da essa), ed accelerati verso altri elettrodi, che hanno fessure attraverso le quali gli ioni passano sotto forma di fascio. Alcuni di questi ioni si frammentano in cationi più piccoli e frammenti neutri. Quando il fascio di ioni "sente" un forte campo magnetico perpendicolare alla sua direzione di moto, gli ioni si deflettono in un arco il cui raggio è inversamente proporzionale alla loro massa. Gli ioni più leggeri sono deflessi in misura maggiore di quelli più pesanti. Variando la forza del campo magnetico, ioni di massa differente possono essere focalizzati progressivamente su di un rivelatore fissato all'estremità di un tubo curvato (anch'esso sotto alto vuoto).

2. La natura degli spettri di massa

Uno spettro di massa viene usualmente presentato sotto forma di grafico a barre verticali, in cui ogni barra rappresenta un ione avente uno specifico rapporto tra massa e carica (m/z) e la lunghezza della barra indica l'abbondanza relativa dello ione. Allo ione più intenso viene assegnato il valore di abbondanza pari a 100, e ad esso si riferisce come il picco di base. La maggior parte degli ioni formati in uno spettrometro di massa hanno carica singola, per cui il valore m/z è equivalente alla massa stessa. I moderni spettrometri di massa distinguono (risolvono) facilmente ioni che differiscono di una sola unità di massa atomica (uma), e quindi forniscono valori completamente accurati della massa molecolare di un composto. Gli ioni di massa più elevata in uno spettrometro sono considerati normalmente ioni molecolari ed gli ioni di massa più bassa sono frammenti di ioni molecolari, presupposto che il campione sia costituito da un singolo composto puro.
Il diagramma seguente rappresenta gli spettri di massa di tre semplici composti gassosi, il biossido di carbonio, il propano ed il ciclopropano. Le molecole di questi composti hanno dimensioni simili, con CO₂ e C₃H₈ entrambi aventi una massa nominale di 44 uma, e con C₃H₆ con massa di 42 uma. Lo ione molecolare risulta più forte negli spettri di CO₂ e C₃H₆, e moderatamente forte nel propano. La risoluzione di una unità di massa atomica appare facilmente in questi spettri (notare la separazione di ioni aventi m/z uguale a 39, 40, 41 e 42 nello spettro del ciclopropano). Sebbene questi composti siano molti simili in dimensioni, diventa semplice identificarli dai loro spettri di massa individuali. Cliccando a turno su ogni spettro, sarà visualizzata una parziale analisi della frammentazione e l'assegnazione del picco. Persino con campioni semplici come questi, si dovrebbe notare che raramente è possibile spiegare l'origine di tutti i frammenti di ioni in uno spettro. Inoltre, la struttura della maggior parte dei frammenti di ioni è di rado conosciuta con certezza.

Poiché la molecola di biossido di carbonio è composta di soli tre atomi, il suo spettro di massa è molto semplice. Lo ione molecolare è anche il picco di base, ed i soli frammenti di ioni sono CO (m/z = 28) e O (m/z = 16). Anche lo ione molecolare del propano ha m/z = 44, ma non è lo ione più abbondante nello spettro. La rottura del legame carbonio-carbonio forma frammenti metilici e etilici, uno dei quali è un carbocatione e l'altro un radicale. Si osservano entrambe le distribuzioni, ma il catione etilico, più grande (m/z = 29), è il più abbondante, probabilmente perché la sua dimensione offre una dispersione di carica più elevata. Un rottura di legame simile nel ciclopropano non forma due frammenti, pertanto lo ione molecolare è più forte del propano, ed infatti esso è responsabile del picco di base. La perdita di un atomo di idrogeno, avvenuta sia prima e sia dopo l'apertura dell'anello, produce lo stabile catione allilico (m/z = 41). Il terzo ione più forte nello spettro ha un m/z = 39 (C₃H₃). La sua struttura è incerta, ma sul diagramma sono mostrate due possibilità. Il piccolo valore di m/z = 39 dello ione del propano e l'assenza di uno ione con m/z = 29 nel ciclopropano sono particolarmente importanti nella distinzione di questi idrocarburi.

I più stabili composti organici hanno un numero pari di elettroni totali, rispecchiando il fatto che gli elettroni occupano gli orbitali atomici e molecolari a coppie. Quando un singolo elettrone è rimosso da una molecola per dare uno ione, il conto totale degli elettroni restituisce un numero dispari, e noi ci riferiamo a tali ioni con il termine di cationi radicalici. Lo ione molecolare in uno spettrometro di massa è sempre un catione radicalico, ma i frammenti di ioni possono essere sia cationi con numero pari di elettroni, sia cationi radicalici con elettroni dispari, a seconda del frammento neutro perduto. Le più semplici e comuni frammentazioni sono da scissioni di legami che producono un radicale neutro (numero dispari di elettroni) ed un catione con numero pari di elettroni. Una frammentazione meno comune, in cui si perde un frammento neutro con elettroni pari, Produce un frammento cationico radicalico con numero dispari di elettroni. I frammenti di ioni possono frammentarsi ulteriormente. Per regola, gli ioni con elettroni dispari possono frammentarsi in ioni sia con elettroni dispari che pari, ma ioni con elettroni pari possono dare altri frammenti di ioni solo con elettroni pari.
Anche le masse degli ioni molecolari e dei frammenti di ioni riflettono il conteggio degli elettroni che dipende dal numero di atomi di azoto presenti nella specie chimica.

Questa distinzione è bene illustrata dai due esempi che seguono. Il chetone insaturo sulla sinistra, il 4-metil-3-pentene-2-one, non ha atomi di azoto per cui la massa dello ione molecolare (m/z = 98) è un numero pari. La maggior parte dei frammenti di ioni hanno masse con numero dispari, e quindi sono cationi con numero di elettroni pari. La dietilmetilammina, a destra, ha un atomo di azoto e la sua massa molecolare (m/z = 87) è un numero dispari. La maggioranza dei frammenti di ioni hanno numeri di massa pari (gli ioni con m/z uguale a 30, 42, 56 e 58 non sono contrassegnati) e sono cationi dell'azoto con elettroni dispari. I deboli ioni con m/z = 15 e 29 sono dovuti ai cationi metilico ed etilico (nessun atomo di azoto). Le frammentazioni principali che forniscono i frammenti ionici più importanti saranno visualizzate cliccando sullo spettro appropriato. Cliccando ripetutamente si otterranno visualizzazioni cicliche.

Quando coppie di elettroni di non-legame sono presenti in una molecola (ad es. O o N), il percorso che porta alla frammentazione si spiega qualche volta presumendo che l'elettrone mancante è parzialmente localizzato su questi atomi. Alcuni di tali meccanismi sono mostrati sopra. La scissione di legami genera un radicale ed un catione, ed entrambi i frammenti spesso condividono questi ruoli, benché in modo non uguale.

3. Isotopi

Poiché uno spettrometro di massa separa e rileva ioni con masse lievemente differenti, esso distingue con facilità isotopi differenti di una dato elemento. Questo fatto si manifesta nel modo più eclatante per i composti contenenti bromo e cloro, come illustrato dagli esempi seguenti. Poiché le molecole del bromo hanno solo due atomi, lo spettro sulla sinistra mostra non senza sorprese che occorre definire la massa atomica del bromo uguale ad 80. I cinque picchi in questo spettro dimostrano con chiarezza che il bromo che si rinviene in natura consiste in una miscela di isotopi vicino a 50:50 aventi masse di 79 ed 80 uma rispettivamente. Quindi, le molecole del bromo possono essere composte da due atomi di ⁷⁹Br (di massa 158 uma), due atomi di ⁸¹Br (162 uma) o più probabilmente da una combinazione di ⁷⁹Br e ⁸¹Br (160 uma). La frammentazione di Br₂ a catione bromuro origina allora due picchi di uguali dimensioni corrispondenti a 79 e 81 uma.

bromo		cloruro di vinile		cloruro di metilene

Lo spettro centrale e quello a destra mostrano che anche il cloro è costituito di due isotopi, con il più abbondante avente una massa di 35 uma ed il meno abbondante con massa di 37 uma. Le composizioni isotopiche precise del cloro e del bromo sono:
        Cloro:     75,77% ³⁵Cl e 24,23% ³⁷Cl
        Bromo:   50,50% ⁷⁹Br e 49,50% ⁸¹Br

La presenza del cloro o del bromo in una molecola o in uno ione si rileva facilmente tenendo conto degli ioni che differiscono di 2 uma. Nel caso del cloruro di metilene, lo ione molecolare consiste di tre picchi a m/z = 84, 86 e 88 uma, e le loro intensità decrescenti possono essere calcolate dalle abbondanze in natura su fornite. La perdita di un atomo di cloro dà due frammenti isotopici di ioni con m/z = 49 e 51 uma, includenti chiaramente un singolo atomo di cloro. Il fluoro e lo iodio, per contro, sono monoisotopici, con masse di 19 e 127 uma, rispettivamente. Dovrebbe essere notato che la presenza di atomi di alogeni in una molecola o in un frammento di ioni non cambia le regole dispari-pari riferite alla massa descritte sopra.

Per utilizzare un calcolatore che prevede i gruppi di isotopi per diverse combinazioni del cloro, bromo ed altri elementi cliccare qui. Questo programma è stato sviluppato al Colby College.

Due altri elementi comuni che hanno isotopi considerevoli sono il carbonio, con abbondanza in natura di ¹³C dell'1,1%, e lo zolfo, con gli isotopi ³³S e ³⁴S con abbondanza in natura di 0,76% e 4,42%, rispettivamente. Per esempio, il debole picco corrispondente a m/z = 99 uma nello spettro del 4-metil-3-pentene-2-one (sopra) è dovuto alla presenza di un singolo atomo di ¹³C nello ione molecolare. Sebbene meno importante in questo contesto, anche ¹⁵N e ¹⁸O danno piccoli contributi ai satelliti con massa più elevata degli ioni molecolari che incorporano tali elementi.

Il calcolatore sulla destra può essere utilizzato per calcolare i contributi degli isotopi all'abbondanza degli ioni di 1 e 2 uma più pesanti dello ione molecolare (M). Semplicemente, inserire un appropriato numero d'indice a destra di ogni simbolo di elementi, lasciando in bianco quegli elementi non presenti, ed agire sul pulsante "Calcola". I numeri che compaiono nelle finestre M+1 e M+2 sono relative ad M regolato al 100%.

4. Modelli di frammentazione

La frammentazione degli ioni molecolari in un assortimento di frammenti ionici rappresenta per il chimico un'alterna fortuna. La natura dei frammenti spesso fornisce un indizio della struttura molecolare, ma se lo ione molecolare ha una vita minore di pochi microsecondi non sopravviverà abbastanza a lungo per essere osservato. Senza il picco di uno ione molecolare come riferimento, la difficoltà di interpretare la massa aumenta in modo rimarchevole. Fortunatamente, la maggior parte dei composti organici forniscono spettri di massa che includono uno ione molecolare, e quelli che non lo fanno, spesso rispondono con successo all'adozione di più miti condizioni di ionizzazione. Tra i composti organici semplici, la maggior parte degli ioni molecolari stabili sono quelli provenienti dagli anelli aromatici, e da altri sistemi con elettroni p coniugati e dai cicloalcani. Alcoli, eteri ed alcani fortemente ramificati mostrano generalmente la più alta tendenza verso la frammentazione.

Lo spettro di massa del dodecano a destra illustra il comportamento di un alcano non ramificato. Poiché non ci sono eteroatomi in questa molecola, non vi sono elettroni di no legame nel guscio di valenza. Di conseguenza, il carattere di catione radicalico dello ione molecolare m/z = 170 è delocalizzato su tutti i legami covalenti. La frammentazione dei legami C-C perchè essi sono generalmente più deboli dei legami C-H e questo produce una miscela di radicali e carbocationi alchilici. La carica positiva risiede normalmente sul frammento più piccolo, per cui vediamo una serie omologa di cationi costituita da esile (m/z = 85), pentile (m/z = 71), butile (m/z = 57), propile (m/z = 43), etile (m/z = 29) e metile (m/z = 15). Questi sono accompagnati da un insieme di corrispondenti carbocationi alchenilici (ad es. m/z = 55, 41 e 27) formati dalla perdita di 2 H. Tutti i frammenti ionici significativi in questo spettro sono con numero pari di elettroni. Nella maggior parte degli spettri degli alcani, gli ioni propile e butile sono i più abbondanti.

La presenza di un gruppo funzionale, particolarmente di uno avente un eteroatomo Y con elettroni di valenza di non legame (Y = N, O, S, X, ecc.), può completamente alterare lo schema di frammentazione di un composto. Questa influenza si pensa che avvenga a causa di una "localizzazione" sull'eteroatomo del catione radicalico componente dello ione molecolare. Dopo tutto, è più facile rimuovere (ionizzare) un elettrone di non legame di uno che fa parte di un legame covalente. Dalla localizzazione della parte reattiva, saranno favoriti certi processi di frammentazione. Questi sono riassunti nel diagramma che segue, dove la finestra ombreggiata in verde mostra esempi di tali ioni molecolari "localizzati". I primi due percorsi di frammentazione conducono a ioni con elettroni pari, e l'eliminazione (percorso 3) produce un ione con numero di elettroni dispari. Notare l'utilizzo di due tipi differenti di frecce curvate per mostrare gli spostamenti di elettroni singoli in confronto con gli spostamenti di coppie di elettroni.

The charge distributions shown above are common, but for each cleavage process the charge may sometimes be carried by the other (neutral) species, and both fragment ions are observed. Of the three cleavage reactions described here, the alpha-cleavage is generally favored for nitrogen, oxygen and sulfur compounds. Indeed, in the previously displayed spectra of 4-methyl-3-pentene-2-one and N,N-diethylmethylamine the major fragment ions come from alpha-cleavages. Further examples of functional group influence on fragmentation are provided by a selection of compounds that may be examined by clicking the left button below. Useful tables of common fragment ions and neutral species may be viewed by clicking the right button.

The complexity of fragmentation patterns has led to mass spectra being used as "fingerprints" for identifying compounds. Environmental pollutants, pesticide residues on food, and controlled substance identification are but a few examples of this application. Extremely small samples of an unknown substance (a microgram or less) are sufficient for such analysis. The following mass spectrum of cocaine demonstrates how a forensic laboratory might determine the nature of an unknown street drug. Even though extensive fragmentation has occurred, many of the more abundant ions (identified by magenta numbers) can be rationalized by the three mechanisms shown above. Plausible assignments may be seen by clicking on the spectrum, and it should be noted that all are even-electron ions. The m/z = 42 ion might be any or all of the following: C₃H₆, C₂H₂O or C₂H₄N. A precise assignment could be made from a high-resolution m/z value (next section).

Odd-electron fragment ions are often formed by characteristic rearrangements in which stable neutral fragments are lost. Mechanisms for some of these rearrangements have been identified by following the course of isotopically labeled molecular ions. A few examples of these rearrangement mechanisms may be seen by clicking the following button.

5. High Resolution Mass Spectrometry

Formula	C6H12	C5H8O	C4H8N2
Mass	84.0939	84.0575	84.0688

In assigning mass values to atoms and molecules, we have assumed integral values for isotopic masses. However, accurate measurements show that this is not strictly true. Because the strong nuclear forces that bind the components of an atomic nucleus together vary, the actual mass of a given isotope deviates from its nominal integer by a small but characteristic amount (remember E = mc²). Thus, relative to ¹²C at 12.0000, the isotopic mass of ¹⁶O is 15.9949 amu (not 16) and ¹⁴N is 14.0031 amu (not 14). By designing mass spectrometers that can determine m/z values accurately to four decimal places, it is possible to distinguish different formulas having the same nominal mass. The table on the right illustrates this important feature, and a double-focusing high-resolution mass spectrometer easily distinguishes ions having these compositions. Mass spectrometry therefore not only provides a specific molecular mass value, but it may also establish the molecular formula of an unknown compound.
Tables of precise mass values for any molecule or ion are available in libraries; however, the mass calculator provided below serves the same purpose. Since a given nominal mass may correspond to several molecular formulas, lists of such possibilities are especially useful when evaluating the spectrum of an unknown compound. Composition tables are available for this purpose, and a particularly useful program for calculating all possible combinations of H, C, N & O that give a specific nominal mass has been written by Jef Rozenski. To use this calculator Click Here.

Molecular Mass Calculator C H N O P S F Cl Br I Molecular Mass

The mass calculator on the right may be used to calculate the exact mass of a molecule based on its elemental composition. Simply enter an appropriate subscript number to the right of each symbol, leaving those elements not present blank, and press the "Calculate" button. Only the mass of the most abundant isotope, relative to C (12.0000), is used for these calculations. For compounds of chlorine and bromine, increments of 1.997 and 1.998 respectively must be added for each halogen to arrive at the higher mass isotope values.